Curcuma | Inhibition de l’infectivité des virus par sa curcumine

Curcuma | Inhibition de l’infectivité des virus par sa curcumine

Tzu-Yen Chen , # 1 Da-Yuan Chen , # 2, ¤ Hsiao-Wei Wen , Jun-Lin Ou , Shyan-Song Chiou , Jo-Mei Chen , Min-Liang Wong , et Wei-Li Hsu 2, *David Harrich, rédacteur – source

Curcumine contre l’infectivité des virus

La curcumine, un composé naturel et un ingrédient du curry, possède des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et anticarcinogènes.

Auparavant, nous avons signalé que la curcumine abrogeait l’infectiosité du virus de la grippe en inhibant l’activité d’hémagglutination (HA). 

Cette étude démontre un nouveau mécanisme par lequel la curcumine inhibe l’infectiosité des virus enveloppés. Dans tous les virus enveloppés analysés, y compris le virus de la grippe, la curcumine a inhibé la formation de plaques. 

En revanche, l’entérovirus 71 non enveloppé n’a pas été affecté par le traitement à la curcumine. 

Nous avons évalué les effets de la curcumine sur la structure de la membrane à l’aide de colorants fluorescents (sulforhodamine B; SRB) contenant des liposomes qui imitent l’enveloppe virale.

Le traitement à la curcumine a induit une fuite de SRB de ces liposomes et l’ajout du virus de la grippe a réduit la fuite, indiquant que la curcumine perturbe l’intégrité des membranes des enveloppes virales et des liposomes. 

Lors du test de liposomes de différents diamètres, nous avons détecté des niveaux plus élevés de fuite de SRB des liposomes de plus petite taille que des liposomes plus gros. 

Fait intéressant, la concentration de curcumine requise pour réduire la formation de plaque était plus faible pour le virus de la grippe (environ 100 nm de diamètre) que pour le virus pseudorabique (environ 180 nm) et le virus de la vaccine (environ 335 × 200 × 200 nm). Ces données fournissent des informations sur les mécanismes antiviraux moléculaires de la curcumine et son utilisation potentielle comme agent antiviral pour les virus enveloppés. 

Nous avons détecté des niveaux plus élevés de fuite de SRB dans les liposomes de plus petite taille que dans les liposomes plus gros. 

Fait intéressant, la concentration de curcumine requise pour réduire la formation de plaque était plus faible pour le virus de la grippe (environ 100 nm de diamètre) que pour le virus pseudorabique (environ 180 nm) et le virus de la vaccine (environ 335 × 200 × 200 nm). 

Ces données fournissent des informations sur les mécanismes antiviraux moléculaires de la curcumine et son utilisation potentielle comme agent antiviral pour les virus enveloppés. 

Nous avons détecté des niveaux plus élevés de fuite de SRB dans les liposomes de plus petite taille que dans les liposomes plus gros. Fait intéressant, la concentration de curcumine requise pour réduire la formation de plaque était plus faible pour le virus de la grippe (environ 100 nm de diamètre) que pour le virus pseudorabique (environ 180 nm) et le virus de la vaccine (environ 335 × 200 × 200 nm). 

Ces données fournissent des informations sur les mécanismes antiviraux moléculaires de la curcumine et son utilisation potentielle comme agent antiviral pour les virus enveloppés.

Introduction

La curcumine (diferuloylméthane), un composé naturel dérivé du curcuma ( Curcuma Longa ) est un épice et un colorant largement utilisé dans les aliments [1] . L’accumulation de preuves suggère que la curcumine présente un certain nombre d’activités pharmacologiques, notamment des activités anti-inflammatoires [2] , antioxydantes [3] et antitumorales [4] , [5] . Des études récentes ont également montré que la curcumine a une activité antivirale [6] , [7] , [8] , [9] , [10] . Dans l’étude de Mazumder et al., La curcumine a inhibé la réplication du VIH [11]. L’interaction spécifique de la curcumine avec les protéines virales intégrase et protéase, qui jouent un rôle central dans la réplication virale, pourrait représenter le mécanisme sous-jacent de cet effet [12] . Kutluay et al. ont également signalé que le traitement à la curcumine inhibait l’expression immédiate-précoce du virus de l’herpès simplex (HSV), peut-être en interférant avec le recrutement de l’ARN polymérase II aux promoteurs de gènes immédiatement-précoces [13] . Dans d’autres études antérieures, la curcumine a inhibé plusieurs voies de signalisation intracellulaire, notamment les voies de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK), la phosphoinositide 3-kinase / protéine kinase B (PI3K / PKB) et le facteur nucléaire kappa B (NF-κB) [14 ] , [15] , [16]et déréglementé le système de protéasome à ubiquitine (UPS) [17] . L’activation de la voie NF-κB est impliquée dans la réplication efficace des virus de l’hépatite C (VHC) [18] et de la grippe [19] . Mazur et al., Ont rapporté que le traitement de l’infection grippale avec des inhibiteurs de NF-κB régulait à la baisse la réplication du virus grippal de manière significative [20] . Cependant, Kim et al. ont décrit que la curcumine inhibe la réplication du VHC en supprimant l’activation d’Akt-SREBP-1, et non par la voie NF-κB [21] . Dans une étude récente, la curcumine a diminué l’infection au coxsackievirus B3 (CVB3) en dérégulant l’UPS, un système requis pour la réplication du CVB3 [6]. Dans l’ensemble, les résultats d’autres groupes de recherche suggèrent que la curcumine exerce une activité antivirale par différents mécanismes dans différents virus; ces mécanismes impliquent une inhibition directe des mécanismes de réplication virale ou la suppression d’une voie de signalisation cellulaire essentielle à la réplication virale.

Dans notre étude précédente, le traitement des cellules avec de la curcumine avant l’infection a considérablement réduit le rendement du virus de la grippe A (IAV) à des doses sous-cytotoxiques [10] . Cela suggère que l’un des effets de la curcumine est médié par la suppression de la signalisation cellulaire, peut-être la voie NF-.B. Plus frappant, l’ajout de curcumine au milieu cellulaire pendant l’adsorption virale a inhibé la production de virus, et le virus de la grippe exposé à la curcumine avant d’infecter les cellules MDCK a inhibé de manière marquée la formation de plaques [10] . Au moyen d’essais d’inhibition de l’hémagglutination (HI), on a en outre démontré que la curcumine interfère avec l’activité de liaison aux récepteurs HA. Collectivement, ces tests impliquaient que la curcumine pouvait interagir directement ou indirectement avec des particules virales pour interrompre le stade précoce de l’infection par l’IAV.

Il a été démontré que la curcumine influence une large gamme de protéines membranaires, en modulant les propriétés de la bicouche lipidique hôte [22] , [23] . Comme la protéine HA est exprimée sur l’enveloppe du virus de la grippe, il vaut la peine d’explorer si l’effet inhibiteur de la curcumine ne concerne que l’activité HA du virus de la grippe ou si elle est nocive pour les protéines membranaires d’autres virus. Dans ce travail, les effets de la curcumine sur l’infectiosité de plusieurs virus ont été étudiés et leurs mécanismes sous-jacents potentiels ont également été discutés.

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Matériaux et méthodes

Culture cellulaire et infection virale

Cellules rénales canines Madin-Darby (MDCK; CCL-34) et cellules rénales de singe vert d’Afrique BSC-1 (CCL-26), achetées auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC), et cellules Vero (ATCC CCL-81), un cadeau du Dr SS Chiou, Institut universitaire de microbiologie et de santé publique, Université Natinoal Chung-Hsing (NCHU), ont été cultivées dans un milieu essentiel minimal (MEM) avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) inactivé par la chaleur, FBS, pénicilline 100 U / ml et streptomycine 10 µg / ml. 

Des cellules de rein de porc (PK-15; BCRC 60057), obtenues à l’origine auprès du Bioresource Collection and Research Center (BCRC) du Food Industry Research and Development Institute of Taiwan, ont été conservées dans le milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM, Hyclone) supplémenté en pénicilline 100 U / ml, streptomycine 10 µg / ml et 5% de FBS inactivé par la chaleur. Avant l’infection,

Le virus de la grippe humaine PR8, A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1), a été amplifié dans des cellules MDCK. Les virus du test d’inhibition de l’hémagglutination (HI) ont été amplifiés dans des œufs de poule embryonnés âgés de 10 jours à 37 ° C pendant 2 jours. 

Le liquide allantoïdien a été récolté et le titre des virus a été déterminé par un test standard de formation de plaque ou un test d’hémagglutination (HA). Le virus de la vaccine, aimablement fourni par le Dr L. Tiley du Département de médecine vétérinaire de Cambridge, au Royaume-Uni, a été cultivé dans des cellules BSC-1. 

Les virus de l’entérovirus 71 (EV71), un cadeau du Dr CW Lin, Département des sciences de laboratoire médical et de biotechnologie, Université médicale de Chine, ont été amplifiés dans des cellules Vero. Des virus pseudorabiques (PRV), obtenus auprès du Dr TJ Chang, ont été cultivés dans des cellules PK-15. 

Le Virus de l’encéphalite japonaise (JEV) et virus de la dengue de type II (DVII), fournis par le Dr SS Chiou, L’Institut universitaire de microbiologie et de santé publique, NCHU, a été cultivé dans des cellules Vero. Les virus de la maladie de Newcastle (NDV) pour le test d’inhibition de l’AH ont été aimablement fournis par le Dr JH Shien, du Département de médecine vétérinaire, NCHU.

Produits chimiques

La curcumine, obtenue auprès de Sigma-Aldrich, a été dissoute dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration de 100 mM et stockée à -80 ° C et a été fraîchement diluée avec du milieu d’infection avant l’expérience.

Test de cytotoxicité

La curcumine, 100 mM dissoute dans du diméthylsulfoxyde (DMSO), a été fraîchement diluée avec du milieu avant l’expérience. 1,5 × 10 5 de cellules cultivées pendant 24 heures dans des plaques à 24 puits ont été lavés avec du PBS et ont été traités avec la curcumine ou du DMSO dilué en série à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 24 heures. 

L’amplification des cellules a été mesurée directement par le nombre total de cellules et le taux de survie a été estimé par le rapport des cellules vivantes / nombre total de cellules par coloration de 0,4% de bleu trypan.

La cytotoxicité a été estimée par comparaison du taux de survie cellulaire des cellules traitées à la curcumine avec celui des cellules traitées au DMSO. Le témoin de traitement fictif a été arbitrairement fixé à 100%.

Plaque Assay

Les cellules MDCK cultivées jusqu’à 80% de confluence ont été lavées deux fois avec du PBS, puis une infection avec des dilutions en série de surnageants contenant des descendants de virus dans un milieu infectieux, c’est-à-dire MEM supplémenté avec 1 µg / ml de trypsine (Worthington, Freehold, NJ, USA) et des antibiotiques. 

Après 2 heures d’absorption à 37 ° C, les inoculums de virus non liés ont été retirés et les cellules ont ensuite été cultivées avec 1 ml / puits de MEM supplémenté avec 0,6% d’agarose à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 2 jours. Les plaques virales ont été visualisées par coloration au Giemsa (Sigma).

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Test d’addition au moment du médicament sur le JEV et l’infection par le virus de la dengue

Dix microlitres de curcumine (ou DMSO, le témoin de solvant) ou ont été ajoutés au milieu à différents moments de l’infection à JEV (200 pfu). 

En bref,

  • (1) traitement à temps plein: la curcumine a été incluse dans le milieu de culture cellulaire pendant 8 h et pendant toute la durée de l’infection; 
  • (2) co-traitement : de la curcumine mélangée avec du JEV dans le milieu infectieux a été simultanément ajoutée sur les cellules et laissée sur les cellules partout; 
  • (3) post-infection: de la curcumine a été ajoutée aux cellules 2 heures après l’infection et est restée pendant toute la durée de l’infection. Après l’adhésion du virus, les inoculums viraux ont été retirés et les cellules Vero ont été cultivées dans du MEM (sans FBS) contenant 1% de méthylcellulose. L’infectiosité a été mesurée en fonction des unités de formation de plaque.
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Plaque Reduction Assay

Pour estimer l’infectiosité des virus après traitement à la curcumine, 2000 pfu de PR8, virus de la vaccine, EV71, JEV, DVII ou PRV ont été pré-incubés avec 30 µM (sauf indication contraire) de curcumine à température ambiante pendant une heure. 

L’infectiosité restante après le traitement à la curcumine a été déterminée par dosage sur plaque. Pour pouvoir mesurer le nombre de formation de plaque, le mélange de virus traités à la curcumine a été encore dilué à 10 -1 , 10 -2 , 10-3 avec du milieu sans FBS et ajouté à des lignées cellulaires appropriées. 

Après 1 heure d’absorption à 37 ° C, les inoculums viraux ont été retirés et les cellules ont ensuite été cultivées avec 1 ml / puits de MEM supplémenté avec 0,6% d’agarose pour la grippe (ou un milieu contenant 1% de méthylcellulose pour les autres virus) à 37 ° C, 5% CO 2pendant 2 jours ou jusqu’à ce que la plaque soit visible. Les plaques virales ont été fixées au méthanol et colorées au cristal violet (Sigma).

Test d’inhibition de l’hémagglutination (HI)

Le titre d’hémagglutination (HA) du stock de virus a été initialement déterminé par dosage HA standard et 4 unités HA (HAU) de virus ont ensuite été utilisées pour le test HI. 

En bref, les stocks de curcumine ont été dilués dans du PBS à une concentration de 1 mM (la concentration la plus élevée du test), et des dilutions en série de curcumine ont été préparées par addition de 25 µl de curcumine (1 mM) dans le puits à 96 puits à fond rond micro-plaques, suivies de dilutions en série 2 fois avec du PBS pour 7 fois.

Vingt-cinq pi de stock de virus ont été ajoutés dans chaque puits et incubés à température ambiante pendant 1 heure. Par la suite, 50 ul de bouillons érythrocytaires de poulet à 0,75% ont été ajoutés à chaque puits. La réaction d’hémagglutination a été observée après 30 min d’incubation.

Test de transfection

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits et cultivées à 90% de confluence. Les 4 µl de Cellfectin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et 0,8 µg de plasmide pEGFP-C1 (Clontech) ont chacun été dilués avec 100 µl d’Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). 

Les deux composants dilués ont été mélangés et incubés à température ambiante pendant 20 min. Ensuite, 30 uM ou DMSO ont été ajoutés au mélange réactif de transfection / ADN et maintenus à température ambiante pendant 40 min avant d’être ajoutés à la monocouche cellulaire. 

L’efficacité de transfection et l’intensité de la GFP dans chaque cellule ont été enregistrées par analyse par cytométrie en flux et microscopie fluorescente 24 heures après la transfection.

Analyse de cytométrie en flux

Les cellules transfectées ont été lavées avec du PBS et récoltées dans 1 ml de PBS. Le signal de l’eGFP a ensuite été analysé au moins 10000 cellules en utilisant un filtre FL-1 par le cytomètre en flux FACS Calibur (BD Biosciences, MA, USA).

Préparation du liposome

Les liposomes fluorescents chargés de colorant SRB ont été préparés par une méthode d’hydratation / congélation et décongélation / extrusion [24]

Le mélange de DPPC, DPPG et de cholestérol dans un rapport molaire de 45-5: 50 a été dissous dans une solution de 6 ml de chloroforme, 1 ml de méthanol et séché dans un évaporateur rotatif. 

Le film lipidique séché a été hydraté par l’addition de 3 ml de solution de SRB 0,15 M (dans HEPES 0,02 M, pH 7,5, osmolalité 530 mmol / kg). La solution lipidique a été traitée avec 5 cycles de congélation et décongélation, puis en fonction de la taille finale des liposomes souhaités, les liposomes ont été extrudés séquentiellement en passant à travers une mini extrudeuse haute pression (Avanti Polar Lipids, Inc., AL, USA) avec différentes tailles de pores (400, 200, puis 100 µm) de membrane en polycarbonate (Whatman, NJ, USA). 

Le SRB non encapsulé a été éliminé par filtration sur gel en utilisant une colonne Sephadex G-50 avec une solution saline tamponnée Tris (TBS: Tris 0,02 M avec NaCl 0,15 M, NaN3 0,01%, pH 7,5) contenant du saccharose (osmolalité 530 mmol / kg).

Traitement des liposomes avec de la curcumine

Un liposome dilué dans du TBS (base Tris 50 mM et NaCl 150 mM, osmolalité 530 mmol / kg) a été incubé avec diverses concentrations de curcumine, DMSO (contrôle négatif) ou 15 mM de n-octylglucoside (n-OG), un détergent servant de contrôle positif, à température ambiante pendant une heure. 

La fuite de fluorescence de la sulforhodamine B (SRB) a été détectée par le lecteur de microplaques SpectraMax M2e (Molecular Devices, Inc., Californie, États-Unis) à une longueur d’onde d’excitation de 490 nm.

Pour tester si le virus de la grippe peut inverser l’effet de la curcumine sur les liposomes, nous avons ajouté 2 doses différentes de particules de virus de la grippe (2000 PFU et 10000 PFU) à la curcumine et aux liposomes chargés de SRB, puis détecté la fluorescence après 1 h d’incubation.

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Dosage temporel du prétraitement à la curcumine

Des particules de virus PR8 (2000 pfu) ont été mélangées avec 30 µM de curcumine dans 200 µl. À 0, 5, 10, 20, 40, 60 min après le traitement à la curcumine, une aliquote de 5 µl a été ajoutée aux cellules MDCK dans un puits contenant 495 µl de milieu infectieux pour rendre la concentration de curcumine inférieure à l’effet inhibiteur viral (soit 0,3 µM). 

L’infectiosité de PR8 a été déterminée par l’analyse de plaque standard pour déterminer l’infectiosité du virus de la grippe.

Caractérisation de l’effet de la curcumine sur la capacité de formation de plaque

Des particules de virus PR8 (2000 pfu) ont été pré-incubées avec 30 uM (sauf indication contraire) de curcumine à température ambiante pendant une heure. 

Par la suite, le mélange de curcumine et de virus a été dilué avec du milieu infectieux frais à la concentration de 6 uM, 3 uM, 1,5 uM et maintenu à température ambiante pendant une heure, suivi par le dosage de plaque standard.

Réplication des virus traités à la curcumine dans les œufs embryonnés

Le protocole d’expérimentation a été approuvé par le Comité d’éthique des expérimentations animales de l’Université nationale de Chung Hsing (approbation n ° 97-91). 

Les œufs de poule embryonnés ont été achetés au Livestock Research Institute de Chunan, Taiwan et incubés en écloserie jusqu’à 10 jours. Cinquante ou 5000 pfu de virus PR8 ont été incubés avec 30 µM de curcumine dans un volume total de 500 µl de milieu infectieux. Une heure après l’incubation, des inoculums ont été injectés dans le sac allantoïdien d’œufs de poule embryonnés. 

Les œufs traités ont été incubés dans un incubateur à 37 ° C pendant 18 ou 24 heures, le rendement de la progéniture virale a été déterminé par test HA.

Analyses statistiques

Toutes les données ont été calculées par Microsoft Excel. Les résultats d’au moins trois expériences indépendantes ont été rapportés sous forme de valeurs moyennes ± moyenne des écarts-types (SEM).

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Résultats

La curcumine bloque l’activité HA du virus de la maladie de Newcastle (NDV)

Dans notre étude précédente, le traitement à la curcumine a abrogé l’activité HA des sous-types IAV H1N1 et H6N1 [10] . Dans cette étude, nous avons traité le paramyxovirus NDV, un autre virus qui présente une activité HA, avec de la curcumine pour déterminer si son effet est spécifique au virus de la grippe. 

Nous avons incubé 4 unités HA de NDV avec diverses concentrations de curcumine pendant 60 min à température ambiante, puis évalué l’agglutination des globules rouges (RBC). 

Les résultats ont montré que le prétraitement à la curcumine (à des concentrations de 31,2 µM ou plus) inhibait la liaison du NDV aux globules rouges du poulet, comme l’indique l’apparence ponctuelle des cellules non hémagglutinées ( figure 1A ).

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Le traitement de la curcumine réduit l’infectiosité des virus enveloppés.

(A) 4 unités HA de virus de la maladie de Newcastle (NDV) ont été incubées avec de la curcumine diluée en série 2 fois ou du DMSO (contrôle de véhicule) et l’activité inhibitrice de l’hémagglutination de la curcumine a été testée par incubation avec du RBC de poulet à température ambiante pendant 30 minutes. 

(B) test d’addition de médicament: 10 µM de curcumine ou de DMSO (comme contrôle de solvant) ont été inclus dans le milieu de culture à différents moments de l’infection par le virus de l’encéphalite japonaise (JEV) ou le virus de la dengue (DV-II) (200 pfu ),

par exemple:

  • (1) traitement à temps plein: de la curcumine a été ajoutée aux cellules vero 8 heures avant l’infection et incluse pendant toute la durée de l’infection,
  • (2) co-traitement: de la curcumine mélangée à un virus dans le milieu infectieux a été ajoutée simultanément aux cellules et laissé sur les cellules partout; 
  • (3) après l’entrée: la curcumine a été ajoutée aux cellules à 2 hpi et est restée pendant toute la durée de l’infection. La plaque de petite taille de DV-II était indiquée par une pointe de flèche. Des résultats cohérents ont été observés à partir d’au moins trois expériences indépendantes.

La curcumine inhibe la formation de plaques dans les virus enveloppés

Il a été indiqué que la curcumine modifie la bicouche lipidique et influence la fonction des protéines membranaires [22] . 

L’enveloppe virale est de structure membraneuse; par conséquent, un test d’addition de médicament a été utilisé pour déterminer si la curcumine peut également inhiber d’autres virus enveloppés. 

Conformément au test de cytotoxicité, 30 µM de curcumine inhibent légèrement la croissance des cellules vero ( Fig. S1 ), et donc 10 µM de curcumine ont été utilisés pour ce test. 

Comme indiqué sur la figure 1B, y compris la curcumine pendant toute la durée de l’infection (c’est-à-dire un traitement à temps plein), a complètement abrogé l’infectiosité de deux flavivirus, JEV et Dengue (type 2; DV-II). 

De façon notable, l’addition de curcumine sur l’attachement viral (c’est-à-dire le co-traitement) a inhibé de manière prononcée la formation de plaques JEV et DV-II; à un degré similaire de traitement à temps plein. En revanche, aucun effet n’a été observé, lorsque la curcumine a été ajoutée après l’entrée virale.

Ces résultats sont cohérents avec l’effet sur le virus de la grippe que la curcumine bloque l’infectiosité du virus en interférant directement ou indirectement la fonction de la protéine d’enveloppe. 

Étant donné que l’activité HA du NDV était également inhibée par la curcumine, nous nous demandons alors si la curcumine affecte généralement l’infectivité des virus enveloppés.

Étant donné que l’IAV, le NDV et le flavivirus analysés dans ce test étaient tous des virus à ARN, un virus à ADN enveloppé, le virus pseudorabique (virus de l’herpès porcin PRV) a ensuite été utilisé pour tester la possibilité. 

L’effet de la curcumine sur l’infectiosité des virus enveloppés a été évalué par le test de formation de plaque. Comme le montre la figure 2A , comme avec celui des virus JEV et DV-II, le prétraitement du PRV, avec 30 uM de curcumine, a fortement inhibé la formation de plaques.

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Le prétraitement de la curcumine inhibe fortement les virus enveloppés, mais n’affecte pas la formation de plaque de l’entérovirus 71 (EV 71).

(A) 2000 pfu de virus Pseudorabie (PRV), de virus de l’encéphalite japonaise (JEV) et de virus de la dengue de sérotype II (DVII) ont été prétraités avec 30 µM de curcumine pendant une heure et l’infectiosité virale restante a été mesurée par test de plaque standard.

Pour compter le nombre de plaques, après une heure d’incubation, le mélange de virus et de médicament a encore été dilué en 10 -1 , 10 -2 , 10-3avec un milieu sans sérum suivi d’un essai sur plaque standard. 

Les taches blanches indiquent des plaques virales. (B – C) Pour mesurer l’effet de la curcumine, 2 000 pfu d’EV71, JEV et du virus de la grippe, la souche PR8 a été prétraitée avec une série de dilutions de curcumine (30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1 µM à 0 uM) pendant une heure et la capacité de formation de plaque a été mesurée par un essai de plaque standard.

La capacité de formation de plaques d’EV71 n’est pas inhibée par la curcumine, alors que l’infectiosité des virus de la grippe a été fortement affectée (B).

Le prétraitement de la curcumine inhibe la formation de plaques du JEV et de la grippe dans une mesure similaire, alors que l’EV71 n’est pas affecté (C). Les résultats de la figure 2C ont été tracés sur la base de trois expériences indépendantes.

Pour déterminer si les effets sur l’infectiosité sont spécifiques aux virus à enveloppe, un virus non enveloppé, l’entérovirus 71 (EV71) a ensuite été inclus dans le même ensemble de tests.

Pour une analyse comparative, 2000 PFU d’EV71, le virus de la grippe et le JEV ont été incubés avec différentes concentrations de curcumine et la viabilité virale a été évaluée à l’aide d’un essai sur plaque. 

Contrairement aux observations de l’IAV et d’autres virus enveloppés (PRV, JEV et DV-II), la formation de plaque EV71 n’est pas affectée par la curcumine à toutes les concentrations analysées ( figure 2B ) et un effet d’inhibition similaire est observé dans l’IAV et le JEV ( Fig.2C ).

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La curcumine perturbe l’intégrité des liposomes

Parce que la curcumine a eu des effets significatifs sur la fonction des protéines HA dans 3 virus enveloppés (2 sous-types IAV et NDV) et également sur la viabilité de 4 virus enveloppés.

Nous avons en outre évalué les effets du prétraitement à la curcumine sur l’intégrité de l’enveloppe virale à l’aide de liposomes, un simple structure lipidique qui imite l’enveloppe virale. 

Cela a été réalisé en utilisant un réactif de transfection à base de liposomes disponible dans le commerce et un liposome chargé de sulforhodamine B (SRB). 

Dans un système basé sur la transfection, l’efficacité de la transfection et le niveau d’expression du gène rapporteur (protéine de fluorescence verte; GFP) dans les cellules indiqueraient la fonction du liposome qui reflète l’intégrité de la structure des liposomes sous traitement à la curcumine. 

Comme le montre la figure 3A, l’incubation du mélange liposome / ADN avec de la curcumine (30 µM) a nettement diminué l’efficacité globale de transfection et a réduit le signal GFP dans les cellules transfectées par rapport aux cellules de contrôle de solvant DMSO. 

Des résultats cohérents ont été observés dans les liposomes fluorescents chargés de SRB. Nous avons observé une fluorescence minimale lorsque le SRB a été encapsulé dans les liposomes. Cependant, après la rupture de la membrane et la libération subséquente de SRB des liposomes, l’émission de fluorescence (longueur d’onde 590 nm) était détectable. 

Les liposomes traités avec 30 µM de curcumine ont montré des niveaux de fluorescence SRB plus élevés que les liposomes traités au DMSO, indiquant que la curcumine induit une fuite du colorant fluorescent ( Fig. 3B). 

Nous avons observé un niveau plus élevé de fuite de SRB des liposomes traités avec 60 µM de curcumine que de ceux traités avec 30 µm de curcumine.

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La curcumine affecte la transfection de l’ADN et la structure des liposomes.

L’effet de la curcumine sur la structure de la membrane a été testé dans deux systèmes, le réactif commercial de transfection à base de liposomes (A) et le liposome chargé de sulforhodamine B (SRB) (B et C). 

(A) La curcumine a été incubée avec le mélange de plasmide eGFP (Clontech) et de Cellfectin (Invitrogen) à température ambiante pendant 40 min avant d’être ajoutée à la monocouche cellulaire. 

À 24 heures après la transfection, l’efficacité de la transfection et l’intensité de la GFP dans les cellules individuelles ont été enregistrées par microscopie fluorescente (panneau supérieur) et analyse par cytométrie en flux (panneau inférieur). Les images ont été prises dans le même cadre. 

(B) les liposomes SRB ont été incubés avec diverses concentrations de curcumine (30 µM, 60 µM), ou DMSO (le contrôle des solvants) à température ambiante pendant une heure, suivi de la détection de la fluorescence SRB

(C) SRB-Liposome a été incubé avec deux doses différentes de virus grippaux PR8 (2000 et 10 000 pfu) et de curcumine (60 µM), ou DMSO à température ambiante pendant une heure. 

La fuite de fluorescence SRB a été détectée par le lecteur de microplaques SpectraMax M2e (Molecular Devices, Inc., Californie, États-Unis) à une longueur d’onde d’excitation de 490 nm. Les résultats de la figure 3B et 3C ont été tracés sur la base de trois expériences indépendantes.

Le liposome, en tant que structure membranaire plus simple, a été utilisé pour imiter la structure de l’enveloppe ( Fig. 3A et B ). 

Nous avons ensuite effectué un test de compétition avec le virus de la grippe pour évaluer si les liposomes chargés de SRB sont un modèle adéquat pour représenter l’enveloppe virale pendant le traitement à la curcumine. 

Vraisemblablement, si le liposome et l’enveloppe virale sont similaires en termes de structure lipidique, l’addition de particules virales était censée concurrencer l’effet de la curcumine sur les liposomes. 

Nous avons ajouté 2 doses de particules du virus de la grippe (2000 PFU et 10 000 PFU) à la curcumine et aux liposomes chargés de SRB, puis détecté la fluorescence après 1 h d’incubation. Les liposomes traités avec de la curcumine seule ont présenté la fluorescence SRB la plus élevée. 

L’ajout du virus de la grippe a réduit la fuite de SRB induite par la curcumine ( Fig. 3C), des doses plus élevées d’IAV réduisant plus efficacement les effets de la curcumine sur les fuites de SRB.

Les effets de la curcumine sur les fuites de SRB dépendent de la taille

Lors de précédents essais de réduction de la plaque, la curcumine a exercé des effets antiviraux importants à des concentrations sous-cytotoxiques, avec un indice sélectif de 92,5 [10] . 

Les enveloppes virales sont dérivées des membranes cellulaires; par conséquent, dans cette étude, nous avons étudié les mécanismes par lesquels la curcumine perturbe sélectivement les bicouches lipidiques dans différents organites. 

Le diamètre du virus de la grippe (80–100 nm) est environ 100 fois plus petit que celui de la cellule de mammifère (10 µm). Nous avons donc étudié l’influence de la taille des particules sur les effets de la curcumine. 

Nous avons traité un nombre similaire de particules de liposomes contenant du SRB de 3 diamètres différents (300, 220 et 120 nm) avec de la curcumine et évalué la fuite de fluorescence. 

Comme le montre la figure 4A, lorsque normalisé avec l’unité de fluorescence dans le contrôle DMSO (par soustraction), nous avons détecté les niveaux les plus bas et les plus élevés de fuite de SRB dans les liposomes de 300 nm et 120 nm de diamètre, respectivement. Cela indique que la curcumine exerce des effets plus puissants sur les liposomes de plus petit diamètre.

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Effet de la curcumine sur les liposomes et les virus de différentes tailles.

(A) Trois diamètres différents de liposome SRB, à savoir 300 nm, 220 nm, 120 nm ont été incubés avec de la curcumine (60 µM), du DMSO (le contrôle des solvants) ou 15 mM de n-octylglucoside (n-OG), un détergent servant comme contrôle positif, à température ambiante pendant une heure. 

La fuite de fluorescence SRB a été détectée par le lecteur de microplaques SpectraMax M2e (Molecular Devices, Inc., Californie, États-Unis) à une longueur d’onde d’excitation de 490 nm. 

(B) Effets de la curcumine sur la formation de plaques de virus enveloppés de différentes tailles. 2 000 pfu de virus grippal (souche PR8) et de deux virus à ADN, à savoir le virus pseudorabique (PRV) et les virus de la vaccine (VAC) ont été prétraités avec 30 µM de curcumine pendant une heure. 

La capacité de formation de plaque a été mesurée par un essai de plaque standard et tracée en pourcentage des témoins non traités. Les lignes en pointillés indiquent une réduction de la formation de plaque de 50% par rapport au groupe témoin. 

Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± écart-type (ET) de trois expériences indépendantes.

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La formation de plaques de virus enveloppés de différentes tailles est influencée par la curcumine

La structure de l’enveloppe des virus est beaucoup plus compliquée que celle des liposomes. L’effet dépendant de la taille a ensuite été testé avec des virus de différentes tailles. 

Nos données antérieures ont indiqué que la curcumine inhibait la formation de plaques dans le JEV et le virus de la grippe (taille similaire) à des degrés similaires, avec une concentration minimale pour l’inhibition complète de 3 µM pour le JEV et de 4 µM pour la grippe ( Fig.2B). 

Nous avons en outre comparé comparativement l’effet de la curcumine sur trois autres virus enveloppés, notamment le virus de la grippe (sous-type H1N1, souche PR8), le PRV et le virus de la vaccine. 

Les virions du virus de la grippe et du PRV sont sphériques avec des diamètres d’environ 80 nm à 120 nm et 150 nm à 200 nm, respectivement. 

Le virus de la Vaccinia, un grand virus à ADN, est en forme de brique et mesure environ 220 nm à 450 (longueur) × 140 nm à 260 nm (largeur) × 140 nm à 260 nm (hauteur) [25]

De manière cohérente, la curcumine a abrogé la formation de plaques dans le virus de la grippe et le PRV à des concentrations ≥30 μµM. Cependant, à des concentrations allant de 0,93 µM à 3,75 µM, le traitement à la curcumine a exercé des effets inhibiteurs plus puissants sur l’infectiosité du virus de la grippe que sur l’infectiosité du PRV. 

La concentration de curcumine requise pour réduire la formation de plaque de 50% par rapport au témoin (CE 50 ) était de 1,15 µM pour la grippe et de 4,61 µM pour le PRV ( figure 5B ). 

Fait intéressant, cet effet dépendant de la taille était plus apparent lorsque l’on comparait les effets inhibiteurs de la curcumine sur le virus de la grippe avec ceux sur le virus de la vaccine. Comme le montre la figure 4B, la curcumine a inhibé l’infectiosité du virus de la vaccine, un virus enveloppé.

Cependant, aucune des concentrations de curcumine analysées n’a été en mesure d’abroger complètement l’infectiosité du virus de la vaccine: la concentration de curcumine la plus élevée (60 µM) a réduit la formation de plaques virales de la vaccine à 30% de celle de l’expérience témoin. 

Cette concentration était sensiblement supérieure à celle requise pour une inhibition à 100% de JEV et la grippe ( Fig. 2B et 4B). 

Ces résultats soutiennent notre hypothèse selon laquelle l’exigence d’une concentration plus élevée de curcumine pour inhiber l’infectiosité des particules virales de plus grand diamètre.

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L’effet de la curcumine sur l’inhibition de la formation de plaques virales et de l’infectiosité est irréversible.

Un traitement chronologique a été effectué pour déterminer le temps nécessaire à la réduction de la plaque (A). 

Le virus de la grippe (50 pfu) a été mélangé avec de la curcumine (30 µM) ou du DMSO (contrôle des solvants). A différentes périodes de temps, c’est-à-dire 0, 5, 10, 20, 40, 60 min d’incubation, les mélanges de médicaments testés pour le virus ont été ajoutés aux cellules, suivis d’un essai sur plaque standard. 

Pour évaluer si l’inhibition induite par la curcumine de la formation de plaque virale peut être restaurée, une heure après le traitement à la curcumine (30 µM), le virus de la grippe (2000 pfu de PR8) et le mélange de curcumine ont ensuite été dilués aux concentrations finales de curcumine à 6 µM, 3 µM et 1,5 µM, suivi par un test de plaque standard (B). 

Pour tester si la perte d’infectivité du virus induite par la curcumine est irréversible, 50 pfu de virus PR8 ont été incubés avec 30 µM de curcumine ou de DMSO dans un volume total de 500 µl de milieu infectieux. 

Une heure après l’incubation, des inoculums ont été injectés dans le sac allantoïde de 4 œufs de poule embryonnés. Les œufs traités ont été incubés dans un incubateur à 37 ° C pendant 18 heures, le rendement de la descendance virale a été déterminé par le test HA (C). 

Des résultats cohérents ont été observés à partir d’au moins trois expériences indépendantes.

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L’inhibition induite par la curcumine de la formation de plaque virale est irréversible

La curcumine pourrait inhiber l’infectiosité virale en perturbant l’intégrité de la membrane ou en interférant avec la fonction des protéines membranaires. 

Cette étude a évalué l’efficacité des effets inhibiteurs viraux de la curcumine ainsi que la réversibilité de ces effets. 

Dans les tests de réduction de la plaque, incubation du virus de la grippe avec de la curcumine (30 µM) pendant 1 h complètement infecté par le virus de la grippe ( Fig. 2 ). 

Nous avons ensuite effectué un traitement chronologique pour déterminer le temps nécessaire à la réduction de la plaque. Les résultats ont indiqué qu’une diminution spectaculaire de la formation de plaque a été observée après que le virus a été exposé à la curcumine pendant 5 min; cependant, un temps de traitement minimal à la curcumine de 40 min est nécessaire pour éliminer complètement la formation de plaque ( Fig. 5A). 

Pour évaluer si la perte d’infectiosité du virus induite par la curcumine peut être restaurée, après un prétraitement de la curcumine, nous avons dilué le mélange virus-curcumine à des doses sous-inhibitrices de curcumine. 

Comme le montre la figure 4B , la concentration minimale de curcumine requise pour l’inhibition complète de la formation de plaque de l’IAV était de -4 µM. 

Si cet effet est réversible, après 1 h de traitement à la curcumine, des dilutions ultérieures du mélange virus-curcumine à des concentrations inférieures à 4 µM devraient restaurer l’infectivité à certains degrés. 

Les résultats ont montré que le traitement à la curcumine, suivi de dilutions en série à des concentrations finales de 6 µM, 3 µM et 1,5 µM, n’a pas inversé les effets de la curcumine, comme l’indique le manque de formation de plaque ( Fig. 5B). 

Cependant, des dilutions du mélange virus-solvant témoin (DMSO) ont rétabli les effets inhibiteurs marginaux du DMSO. 

Nous avons ensuite utilisé l’œuf de poule embryonnaire, un puissant vaisseau d’amplification du virus de la grippe, pour déterminer si l’irréversibilité du traitement à la curcumine inhibait le virus de la grippe. 

Les virus prétraités à la curcumine (pendant une heure) n’ont pas pu s’amplifier dans les œufs embryonnaires. 

Cependant, les œufs inoculés avec une dose élevée (5000 PFU) de PR8 traités avec du DMSO ont produit 2 unités 5,5 HA et 2 unités 9,75 HA de progéniture virale à 18 h et 24 h après l’infection, respectivement ( tableau 1 et figure 5C ). 

Ces résultats ont indiqué que les effets inhibiteurs de la curcumine sur l’infectiosité du virus de la grippe sont irréversibles.

Table 1

Rendement du virus dans les œufs embryonnaires infectés par le virus de la grippe prétraité à la curcumine.

Curcumine (+)Curcumine (-)
Rendement de la descendance virale: titre HA (2 * )Rendement de la descendance virale: titre HA (2 * )
Virus utilisé18 hpi24 hpi18 hpi24 hpi
50 pfu0.000.000.008.25±1.71
5000 pfu0.000.005.5±0.589.75±1.26

* Les valeurs du titre HA représentent la moyenne ± SEM pour quatre expériences indépendantes.

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Discussion

Cette étude présente plusieurs nouvelles découvertes. 

À notre connaissance, il est le premier à montrer que la curcumine inhibe généralement l’infectiosité du virus enveloppé. 

En plus d’inhiber l’activité HA, un nouveau mécanisme a été étudié; comme en témoignent les systèmes de dosage à base de liposomes, nous avons proposé que l’intégrité de la structure de la membrane, par exemple l’enveloppe virale, puisse être affectée par le traitement à la curcumine. 

Quant aux quatre virus enveloppés analysés dans la présente étude, la CE 50 de la curcumine sur l’inhibition de la formation de plaque pour les virus plus gros est supérieure à celle pour les virus plus petits.

Des études antérieures ont rapporté que la curcumine s’associe aux membranes [26] , [27] . 

Les propriétés hydrophobes des membranes favorisent l’intercalation de la curcumine dans la bicouche lipidique, comme dans les membranes cellulaires, où les anneaux phénoliques de la curcumine sont essentiels pour l’interaction avec les sites de liaison hydrogène. 

Plusieurs études ont également identifié la curcumine comme un agent perturbant la membrane. 

Le traitement à la curcumine a induit des altérations des propriétés membranaires, notamment des changements morphologiques, ainsi qu’une augmentation de la perméabilité et de la fluidité. 

Les interactions entre les membranes cellulaires et la curcumine pourraient avoir provoqué ces effets [26] , [28].

Jaruga et al. ont observé que le traitement des érythrocytes avec des concentrations de curcumine> 100 µM induisait des modifications de l’intégrité de leurs membranes cellulaires [26] , [27] . 

De même, à une concentration de traitement élevée (5 mM), la curcumine augmente les fuites de lactate déshydrogénase (LDH) dans les hépatocytes de rat (25%) par rapport à la fuite de LDH observée dans les cellules non traitées (15%) [29] .

La recherche utilisant un modèle de thymocytes de rat a en outre montré que la curcumine est capable de pénétrer le cytoplasme et de s’accumuler dans les structures membraneuses des organites intracellulaires et de la membrane nucléaire. 

En plus d’induire des changements morphologiques, le traitement à la curcumine a diminué les potentiels membranaires mitochondriaux [28]

Dans d’autres études, la curcumine a influencé la fonction de plusieurs protéines, comme le récepteur du facteur de croissance épidermique [30] et la glycoprotéine P [31] . 

Ces résultats suggèrent qu’en plus des effets de la curcumine sur les structures membranaires, les interactions entre les groupes phénoliques de la curcumine et les sites de liaison hydrogène dans les membranes cellulaires pourraient influencer les activités membranaires ou la fonction des protéines membranaires.

Dans notre étude précédente, la curcumine interférait efficacement avec l’activité HA du virus de la grippe [10] . 

Dans cette étude, l’activité HA a été inhibée de manière significative dans le NDV traité avec des concentrations de curcumine supérieures à 30 µM. La protéine hémagglutinine-neuraminidase (HN) est responsable de l’activité HA du NDV. 

Étant donné que la séquence et la conformation de la protéine HN sont différentes de celles de la protéine HA du virus de la grippe, l’inhibition de la fonction HA dans les deux virus après le traitement à la curcumine a suggéré que les effets HI pourraient résulter de différents mécanismes ou d’un effet perturbateur général sur le virus. enveloppe. 

Suite au traitement de plusieurs virus enveloppés et d’un virus non enveloppé, EV71 ( Piconaviridae) avec la curcumine, nous avons observé que les effets de la curcumine sur l’inhibition de la formation de plaques virales sont spécifiques aux virus enveloppés : l’infectiosité d’EV71 n’est pas affectée par le traitement à la curcumine. 

Étant donné que les 7 virus enveloppés, dont le virus de la grippe A (sous-types H1 et H6), le virus pseudorabique, 2 flavivirus (JEV et virus Dengue), le virus de la vaccine et le NDV, sont classés en 5 familles, il a suggéré que la curcumine exerce un effet inhibiteur général sur les virus à structure enveloppe. 

Étant donné que le prétraitement des virus avec de la curcumine a abrogé de manière irréversible la formation de plaques et l’activité HA, cela a indiqué que la curcumine pourrait servir d’agent virucide pour les virus enveloppés.

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Dans cette étude, la concentration de curcumine nécessaire pour inhiber l’activité HA virale (30 µM) est inférieure à celle rapportée dans notre étude précédente [10] , et celles rapportées par d’autres groupes de recherche comme perturbatrices des membranes érythrocytaires [26] , [27] . 

Dans les tests HI, nous avons observé une hémolyse à des concentrations de curcumine supérieures à 500 µM. Le prétraitement des globules rouges avec 30 µM de curcumine n’a eu aucun effet sur l’activité HA des virus de la grippe, ce qui indique que la membrane érythrocytaire reste intacte aux concentrations de curcumine efficaces pour l’inhibition de HA. 

À des concentrations inférieures à 30 µM, nous avons observé des effets toxiques cellulaires insignifiants. Cependant, la CE 50 requise pour l’inhibition du virus de la grippe était d’environ 0,47 µM (avec un indice sélectif, CC50 / CE 50 , de 92,5) [10]

Ces observations ont indiqué que, malgré les enveloppes virales et les membranes cellulaires composées d’une bicouche phospholipidique, la curcumine (30 µM) inhibe sélectivement l’infectiosité des particules virales en perturbant la fonction des protéines enveloppées virales, telles que la protéine HA du virus de la grippe et la Protéine HN du NDV. 

La viabilité cellulaire, cependant, n’est pas affectée par le traitement à la curcumine. Plusieurs facteurs pourraient contribuer aux effets perturbateurs de la curcumine sur différents virus et cellules, tels que la complexité des compositions de protéines de surface et la taille des particules virales. 

De nombreuses protéines de surface se fixent aux membranes cellulaires, tandis que peu de protéines s’ancrent à la surface des particules virales: trois protéines d’enveloppe (HA, NA et M2) sur le virus de la grippe, deux protéines d’enveloppe (HN et F) sur NDV et deux protéines ( E et M) sur les flavivirus. 

Compte tenu des rôles essentiels de chacune de ces protéines virales dans l’infection virale, il est probable que l’interruption de la fonction de toute protéine virale de surface par interaction directe avec la curcumine, ou comme effet séquentiel résultant d’une perturbation de l’enveloppe virale par la curcumine, aurait un effet plus effet significatif sur l’infectiosité du virus que sur la cellule. 

Dans différents virus, 30 µM de curcumine ont complètement abrogé le virus de la grippe A et l’infectiosité du JEV (Fig. 2B ), mais a eu des effets inhibiteurs minimes sur l’infectiosité du virus de la vaccine (Fig. 4B ). 

En général, par rapport aux virus à ADN, les virus à ARN ont un génome de plus petite taille, codant pour moins de protéines et une structure d’enveloppe simple. 

Parmi les 4 virus utilisés pour l’analyse comparative, le virus de la grippe A et le JEV sont des virus à ARN, avec des particules virales d’environ 50 nm à 100 nm, et contiennent 2 ou 3 protéines d’enveloppe. 

En revanche, la particule virale de la vaccine est considérablement plus grande, 220 nm à 450 nm (longueur) × 140 nm à 260 nm (largeur) × 140 nm à 260 nm (hauteur), avec une structure plus complexe [32].

Il est possible que l’interférence des protéines d’enveloppe ait des effets néfastes minimes sur la réplication du virus de la vaccine, ou que d’autres protéines ayant des fonctions similaires puissent compenser la perte de cette activité. 

De même, cela peut expliquer les effets inhibiteurs sélectifs de la curcumine sur les virus: la constitution de protéines de surface sur la membrane cellulaire est beaucoup plus compliquée que l’enveloppe virale, et le diamètre moyen d’une cellule varie de 10 µm à 50 µm; environ au moins 100 fois plus grand que celui du virus de la grippe. 

À des concentrations de traitement identiques, la curcumine aurait donc des effets plus puissants sur les petites particules virales que sur les cellules.

Des études antérieures ont décrit les effets inhibiteurs de la curcumine sur plusieurs virus enveloppés (tels que le VIH, le virus de la grippe A, le virus de l’herpès simplex, le virus de l’hépatite B) [7] , [8] , [9] , [10] , [13] and on un virus non enveloppé, le coxsackievirus B3 [6] . 

Dans cette étude, l’infectiosité d’EV71, qui est classée dans le même genre que le coxsackievirus B3 ( PicornaviridaeEntérovirus), n’a pas été affecté par le traitement à la curcumine. 

Différents modèles expérimentaux pourraient avoir causé ces résultats incohérents. Les systèmes de dosage (réduction de la plaque et HI) de cette étude ont évalué les effets de la curcumine sur les particules virales et n’ont pas pris en compte ses effets sur les cellules. 

Cependant, l’étude de Si et al. ont étudié les effets cellulaires de la curcumine, observant la suppression de la réplication du coxsackievirus B3 par une dérégulation de l’UPS [6] . 

Ces différentes observations indiquent que la curcumine inhibe l’infection virale par de multiples mécanismes.

L’accumulation de preuves suggère l’utilisation potentielle de la curcumine comme médicament antiviral; cependant, les mécanismes qui sous-tendent ses effets biologiques à large spectre doivent encore être entièrement élucidés. 

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Nos résultats indiquent que la curcumine a une activité antivirale potentielle pour une variété de virus enveloppés analysés dans cette étude en raison de ses propriétés de perturbation membranaire (ou de modification des protéines membranaires). 

Cette nouvelle découverte implique que lors de l’évaluation des mécanismes de l’activité antivirale induite par la curcumine sur la base de l’expérience de temps d’addition de médicament, une mauvaise interprétation des observations est possible.

Une conception expérimentale typique pour l’étude de l’activité antivirale de la curcumine est l’ajout de curcumine à un milieu de culture cellulaire avant et / ou au cours de l’infection [6] , [13]

En présence de curcumine, la charge virale efficace diminuerait considérablement pendant l’absorption virale (avant l’entrée virale). Par exemple, l’addition simultanée du virus de la grippe et de la curcumine à une culture cellulaire a réduit le rendement du virus à <5% de celui du contrôle, et les virus pré-exposés à la curcumine avant d’infecter les cellules MDCK ont inhibé de manière marquée la formation de plaques.

La réduction initiale de la charge virale efficace contribuerait ainsi à la réduction des rendements viraux. 

L’étude de certaines protéines de signalisation cellulaire impliquées dans l’activité antivirale dépendante de la curcumine pourrait alors être trompeuse car les réductions de la réplication virale ou du rendement pourraient ne pas être exclusivement dues aux effets cellulaires, résultant également des effets de la curcumine sur les particules virales au cours des premiers stades de l’infection. 

Une conception expérimentale appropriée pour étudier les effets de la curcumine sur les virus enveloppés devrait éviter l’incubation simultanée des virus d’essai avec la curcumine pendant l’absorption virale ou le prétraitement du virus avec la curcumine.

La curcumine pourrait cependant être incluse dans la culture cellulaire: (I) avant l’infection mais éliminée lors de l’absorption virale (c’est-à-dire le traitement des cellules avec de la curcumine) pour évaluer l’établissement du statut antiviral en réponse au traitement à la curcumine; et (II) après la fusion des membranes cellulaires avec l’enveloppe virale, ou à des moments choisis après l’entrée virale, pour déterminer les effets de la curcumine sur les procédures de réplication virale et pour évaluer la contribution de la machinerie cellulaire pendant l’infection virale.

Renseignements à l’appui

Figure S1

Test de cytotoxicité de la curcumine. Les cellules Vero cultivées dans des plaques à 96 puits (pour le test MTT) ou à 24 puits (pour l’analyse de la survie cellulaire) pendant 16 heures ont été lavées avec du PBS et ont été traitées avec du DMSO (témoin) ou de la curcumine aux concentrations indiquées à 37 ° C, 5% CO 2pendant 24 heures. 

La prolifération des cellules a ensuite été mesurée par le test MTT standard (MTT obtenu auprès de Sigma-Aldrich) (A), ou directement par le nombre total de cellules (B). (A) Pour le test MTT, les cellules ont été lavées avec du PBS et ont ensuite été traitées avec 100 microlitres de solution de MTT (0,5 mg / ml) pendant une heure. 

Par la suite, les cristaux bleus ont été solubilisés avec HCl 0,04 N dans de l’isopropanol absolu et l’intensité est mesurée par colorimétrie à 570 nm. (B) Le taux de survie cellulaire a été estimé par le rapport des cellules vivantes / nombre total de cellules après coloration au bleu trypan à 0,4%. La cytotoxicité a été estimée par comparaison du taux de survie cellulaire des cellules traitées à la curcumine avec celui des cellules traitées par simulation (0 µM). 

Le témoin de traitement fictif a été arbitrairement fixé à 100%. Les résultats ont été tracés sur la base de trois expériences indépendantes.

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Remerciements

Les auteurs remercient le Dr Kuan-Hsun Lin pour le soutien technique. Cette étude a été financée en partie par le National Science Council, Taiwan (98-2313-B-005-015-MY3, 101-2321-B-005-005) et l’Université nationale Chung-Hsing (TCVGH-NCHU1017612).

Déclaration de financement

Ce travail a été soutenu par des subventions du National Science Council (98-2313-B-005-015-MY3, 101-2321-B-005-005) et de l’Université nationale de Chung-Hsing (TCVGH-NCHU1017612). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

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